ELISA細(xì)節(jié)盤點

1. 樣本收集

每個標(biāo)本量收集體積=100ulx檢測指標(biāo)，如要做復(fù)孔，標(biāo)本量收集體積=10Oul×檢測指標(biāo)×2。對收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測的標(biāo)本，儲存在4℃?zhèn)溆茫缬刑厥庠蛐枰芷谑占瘶?biāo)本，將標(biāo)本及時分裝后放在-20°℃或-70°℃條件下保存，避免反復(fù)凍融。標(biāo)本2-8℃可保存48小時，-20°℃可保存1個月。-70度可保存6個月。部分激素類標(biāo)本需添加抑肽酶。如需離心的樣本，離心轉(zhuǎn)速不宜過高(2000~3000)

2. ELISA加樣

加樣品時，單孔用量要求: ≥50ul/指標(biāo)，如需要做2個復(fù)孔則血量≥100ul/指標(biāo)。如果樣本量不充足，具體用量可咨詢您的專屬銷售。

3. 樣品捕獲抗體孵育

37C恒溫孵育，避免溫度變化過大

4. 洗滌

機洗: 將25x×洗滌緩沖液稀釋成1×，1×洗滌緩沖液洗三次，每次加300uL浸泡60s手洗:手洗次數(shù)應(yīng)比機洗次數(shù)多，浸泡時間也應(yīng)適當(dāng)延長

手洗容易導(dǎo)致吸附在酶標(biāo)板底部的試劑脫落，從而導(dǎo)致結(jié)果偏小，手洗次數(shù)過多也會影響實驗結(jié)果，建議機洗

5. 底物顯色（TMB顯色) 孵育

TMB在使用前應(yīng)放置室溫平衡30分鐘，加的量為A、B各50uL

6. ELISA終止液終止反應(yīng)

加完TMB終止液應(yīng)讓其混勻再在酶標(biāo)儀上讀數(shù)

7. 酶標(biāo)儀讀數(shù)

在450nm波長處測定O.D值

8. 根據(jù)O.D值計算樣本濃度

使用軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度(r或R2）以及殘差平方和（s）選擇合適的曲線。

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